准确、高灵敏且快速的检测技术（Point of Care Testing，POCT）是疾病诊断、食品安全、环境监测等生命健康相关领域的重要保障。检测技术包括信号（光、电、磁等）产生单元、分子识别单元、信号输出单元三个模块及相关试剂与分析平台，其中，信号产生单元是检测技术研发的核心，主要涉及生物标记探针，其决定技术原理与灵敏度。凭借高灵敏、可视化、无损检测的优势，荧光技术在POCT领域获得了广泛的认可。然而，生物样本中背景荧光、散射光等光学干扰会显著降低信噪比，导致其在低丰度靶标的样本检测上受限。针对上述问题，中国科学院宁波材料技术与工程研究所基因与体外诊断技术团队郑建萍研究员和王宇辉副研究员在新型荧光纳米微球标记探针及其快速检测应用方面取得系列进展。

　　近红外激发的稀土上转换发光技术可有效避免待检样本中背景荧光等光学干扰，显著提高灵敏度。但是，上转换发光纳米微球（UCNPs）的水溶性修饰与生物功能化会导致表面状态的改变与荧光衰减。针对该问题，团队发展了一种超分子（葫芦脲[7]）自组装修饰UCNPs的技术，其提高了UCNPs的水溶性、光稳定性及抗体锚定效率。作为一种标记探针，超分子功能化的UCNPs在免疫层析检测卡中表现出明显的竞争优势，对达氟沙星抗生素和大肠杆菌（O157:H7）的检出限分别达到0.04ng/mL, 7×10²cfu/mL，最终成功应用于牛奶样本中靶标的现场快速筛选（图1）。相关成果以“Improving the performance of up-conversion nanoprobe-based lateral flow immunoassays by supramolecular self-assembly core/shell strategies”为题发表在Sensors and Actuators B: Chemical., 2020, 318, 128233 （https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128233）。

　　分子信标是一种基于荧光共振能量转移（FRET）的均相核酸检测技术，具有设计简单、特异性好的优势，其灵敏度取决于荧光供体的光学性能及供受体间的能量转移效率。针对常见分子信标存在的背景干扰、灵敏度偏低及有机磷光供体分子水溶性差等问题，团队发展了一种新型的近红外长余辉分子信标探针检测技术（图2）。利用样本中本底荧光与长余辉探针（PLNPs）在寿命上的差异，时间分辨技术可彻底消除背景信号。所构建的长余辉分子信标对miR21的检测灵敏度达到0.086nM，比近红外商用染料探针高1-2个数量级，并成功应用于血样与胞内miR21水平的实时快速、定量筛选，充分展示了长余辉时间分辨技术在生物检测上的优势。相关成果以“A persistent luminescence resonance energy transfer-based molecular beacon probe for the highly sensitive detection of microRNA in biological samples”为题，发表在Biosensors and Bioelectronics, 2022, 198, 113849 (https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113849)。

　　尽管上述具备特殊发光性质的长余辉/上转换发光纳米材料与在克服背景干扰，提高检测信噪比方面具有独特优势，但是，存在光量子效率低、需要特定激发光源或检测器等局限，使得相关便携式荧光定量分析仪的开发成本显著提高。荧光碳点凭借制备简单、发光性能好、化学惰性、易表面修饰等优点，是一类有潜力和竞争力的标记材料。然而，碳点的极小尺寸（＜5nm）会带来两个问题，一是表面有限的生物修饰位点，且生物偶联时会存在单个抗体同时偶联上多个碳点而导致荧光淬灭；二是单个碳点的荧光强度整体相对偏弱。

　　针对上述问题，团队在前期荧光碳点标记探针及分析应用的研究基础上（Biosens. Bioelectron.,（2017, 90, 501; 2017, 97, 150）; Anal. Chem.,2017, 89, 5542; Nanoscale（2018, 10, 17834; 2018, 10, 1532）; Chem. Eur. J., 2018, 24, 4703; Analyst,（2019, 144, 468; 2020, 145, 2982.）），分别基于碳化交联与介孔硅负载技术，合成制备了荧光碳纳米微球（FCNBs）和碳点-介孔硅共价复合荧光微球（CD-MSNs），并开展了其在免疫标记分析中的应用研究。FCNBs以有机小分子与枝状聚乙烯亚胺（PEI）为原料，通过溶剂热一步碳化交联而获得，其制备简单、水溶性好、尺寸均匀（50-70nm）、光量子效率高（90.1%）、表面具有丰富的功能基团，特别适宜生物标记。基于免疫亲和与核酸适体分子识别原理（图3），分别设计和构建了基于竞争法和夹心法检测黄曲霉毒素1（AFB1）与金黄色葡萄球菌（S. aureus）的荧光层析技术与试纸条，相应的定量检出限分别达到0.01ng/mL、10²cfu/mL，比现有胶体金、商用荧光微球低1-2个数量级，相关研究成果“An Emerging Fluorescent Carbon Nanobead Label Probe for Lateral Flow Assays and Highly Sensitive Screening of Foodborne Toxins and Pathogenic Bacteria”为题，发表在Analytical Chemistry, 2022, 94, 11514-11520 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01430)。CD-MSNs利用介孔硅独特的孔道结构，共价负载高密度的硅烷化碳点，显著提高了探针的荧光强度，且有效避免包埋微球中常出现的荧光泄露问题。该荧光微球尺寸均匀（240 nm）、分散性好、易表面功能化，同样适用于生物标记。基于免疫识别原理（图4），分别制备了AFB1与S. aureus的试纸条，相应的定量检出限达到0.05ng/mL、10²cfu/mL，可实现单液滴下1个S. aureus菌落的检出，相关研究成果以“An ultrasensitive lateral flow immunoassay platform for foodborne biotoxins and pathogenic bacteria based on carbon-dots embedded mesoporous silicon nanoparticles fluorescent reporter probes”为题，发表在Food Chemistry, 2023, 399, 133970（https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133970）。上述荧光检测卡均成功应用于食品样本（牛奶、肉制品、花生、豆类等）中污染因子的高灵敏、快速筛选。

　　以上研究得到浙江省自然科学基金（LY20B050003）、宁波市3315创新团队项目（2019A-14-C）、宁波市科技攻关重大专项（2016C50009，2018B10054）等项目的资助。此外，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室赖卫华教授、上海理工大学周化岚博士、中国农科院油料所李慧副研究员等合作者参与了部分工作。

图1 稀土上转换发光粒子及其免疫层析技术构建示意图

图2 长余辉分子信标探针的构筑与miR21传感原理示意图

图3 FCNBs探针制备、竞争法检测AFB1原理及实际样本筛选应用

图4 碳点-介孔硅共价复合荧光微球标记探针构建及其免疫层析应用