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化疗是当前癌症治疗的一线方法，然而在化疗中经常出现的癌症耐药性——癌细胞逃脱药物的抗癌作用，已成为临床上导致癌症治疗失败的主要难题。由于肿瘤的异质性，开发单细胞水平诊断癌症耐药性的材料和方法至关重要，以识别异质性肿瘤中的耐药肿瘤细胞亚群，监测癌症耐药性的进展，进而确立有效的治疗方案。然而，目前单个细胞的耐药性仅可通过价格高昂的单细胞测序来进行，且检测过程会完全破坏细胞，尚没有精准、便捷、无损的癌症耐药性单细胞水平检测手段。
基于此，窦红静教授团队从纳米材料优异的可设计性出发，利用纳米颗粒与细胞的特异性相互作用来标记和编码耐药肿瘤细胞亚群，并探究了这类材料在癌症化疗耐药性单细胞诊断中的应用。
研究中首先合成了一系列具有不同物理化学性质的荧光纳米颗粒，分别是无机二氧化硅（SiO2）荧光纳米颗粒、有机聚苯乙烯-co-丙烯酸（PS-co-PAA）荧光纳米颗粒以及金属有机框架ZIF-8荧光纳米颗粒。这些纳米材料具备不同的化学组成、尺寸、形状以及表面电位，表现出良好的荧光性能，且对多种肿瘤细胞均无细胞毒性。
通过探究上述荧光纳米材料与不同种类化疗耐药肿瘤细胞以及相应药物敏感肿瘤细胞之间的相互作用，发现SiO2荧光纳米颗粒和PS-co-PAA荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞和药物敏感肿瘤细胞中的富集浓度相仿，而ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞中的富集量仅为药物敏感肿瘤细胞中的15 ~ 50%。因而，可利用ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞中特异性的低富集来进行耐药肿瘤细胞亚群的标记与编码。
进一步，发现ZIF-8荧光纳米颗粒以不依赖网格蛋白/小窝蛋白的内吞方式进入耐药肿瘤细胞，且P-糖蛋白相关的耐药肿瘤细胞膜流动性降低显著影响了其在细胞内的富集。ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞以及药物敏感肿瘤细胞中差异化的富集所产生的不同荧光强度，提示了其在鉴别耐药肿瘤细胞方面的潜力（示意图1）。
相关工作以“Single-Cell Diagnosis of Cancer Drug Resistance through the Differential Endocytosis of Nanoparticles between Drug-Resistant and Drug-Sensitive Cancer Cells”发表在ACS Nano，通讯作者分别是上海交通大学材料学院窦红静教授，瑞金医院呼吸科周敏主任医师以及瑞金医院病理科陈晓炎医生。
功能化荧光纳米颗粒的制备
基于ZIF-8材料，二氧化硅纳米颗粒以及聚合物纳米颗粒在癌症诊疗中的广泛应用，且具有截然不同的化学组成，选取此三类典型的纳米颗粒进行设计以构建功能化荧光纳米材料，最终得到了三组具有不同的组成成分、表面形貌以及zeta电位的荧光纳米颗粒，分别是ZIF-8荧光纳米颗粒（ZNPs）、SiO2荧光纳米颗粒（SNPs）以及PS-co-PAA荧光纳米颗粒（ONPs），且每种纳米颗粒具备三种不同的尺寸，为探究纳米颗粒与细胞的相互作用提供了条件。
纳米颗粒与耐药肿瘤细胞的相互作用
将制备得到的纳米颗粒与不同种类的化疗耐药肿瘤细胞以及药物敏感肿瘤细胞共孵育，以纳米颗粒在药物敏感肿瘤细胞中的富集作为标准（100%），发现大量SiO2荧光纳米颗粒（100%）或PS-co-PAA荧光纳米颗粒（100%）富集在耐药肿瘤细胞中，而只有少量ZIF-8荧光纳米颗粒（15 ~ 50%）在耐药肿瘤细胞中富集，且这种现象在多种耐药肿瘤细胞中发生。
P-gp相关的耐药肿瘤细胞膜流动性降低的影响
基于ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞以及药物敏感肿瘤细胞中的不同行为，进一步研究耐药肿瘤细胞的耐药性以及其他分子特性对纳米颗粒富集的影响。研究发现ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞中的富集程度与肿瘤细胞MDR1基因的表达水平呈负相关，且MDR1基因的表达产物P-gp相关的细胞膜流动性降低是导致ZIF-8荧光纳米颗粒在耐药肿瘤细胞中低富集的关键因素。
内吞通道的影响
基于ZIF-8纳米颗粒不同于SiO2纳米颗粒以及PS-co-PAA纳米颗粒的表现，进一步考虑纳米颗粒进入细胞的内吞通道对纳米颗粒在细胞内富集的影响。研究发现ZIF-8荧光纳米颗粒通过不依赖网格蛋白/小窝蛋白的内吞通道进入耐药肿瘤细胞，这种内吞方式导致纳米颗粒进入耐药肿瘤细胞与P-gp相关的耐药肿瘤细胞膜流动性降低高度相关。而SiO2荧光纳米颗粒以及PS-co-PAA荧光纳米颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，内吞过程不受耐药肿瘤细胞膜流动性降低的影响，从而在耐药肿瘤细胞中保持高水平的细胞内富集。
ZIF-8荧光纳米颗粒单细胞水平诊断癌症耐药性
基于ZIF-8荧光纳米颗粒与耐药肿瘤细胞独特的相互作用，且这种细胞内富集结果与肿瘤细胞耐药性直接相关，我们因此探究了ZIF-8纳米颗粒在单细胞水平诊断临床样本癌症耐药性的潜力。通过与3例来自肺癌临床样本的细胞悬液共孵育，并与此3例临床样本的单细胞测序结果做对照，发现ZIF-8荧光纳米颗粒成功诊断出肺癌临床样本中的耐药肿瘤细胞比例及其耐药性水平，表现出癌症化疗耐药单细胞诊断的潜力。这对于明确临床样本对化疗药物的敏感性以及监测其化疗耐药性的进展具有重要意义。
小结
本工作通过研究三种典型的荧光纳米颗粒(ZNPs、SNPs和ONPs)与多种耐药肿瘤细胞的相互作用，建立了基于ZIF-8纳米颗粒的癌症耐药性单细胞检测平台。
值得指出的是，窦红静研究组前期对于多种多糖纳米凝胶与化疗耐药癌细胞之间的相互作用已进行了一系列研究，发现表面电荷接近中性的多糖纳米凝胶也具备与ZIF-8纳米颗粒相仿的耐药癌细胞标记与分选功能(Nano Research, 2020, 11(13), 3110; Advanced Biosystems, 2020，4(2), 1900213)，并对利用这一方法定量进行癌症耐药单细胞检测的可行性进行了系统研究 (ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(46), 51798)。
本工作则在前期基础上，对于相关机制进行了深入探讨，发现纳米颗粒的细胞内吞途径以及P-gp相关的耐药细胞膜流动性降低是决定纳米颗粒在耐药肿瘤细胞中低富集的关键因素。
相关的一系列研究提出了一种在单细胞水平快速、精准、无损地检测活细胞化疗耐药性的方法。这种方法表现出了无损无毒鉴定耐药肿瘤细胞的巨大潜力，不仅可以用于鉴定异质性肿瘤中的耐药肿瘤细胞亚群并明确其比例，而且表现出诊断临床样本癌症耐药性的巨大潜力。
上海交通大学
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